Evaporatif Işık Saçılım Dedektörü (ELSD), gazlı parçacıklar oluşturabilen herhangi bir bileşiğe teorik olarak uygulanabilen yeni bir kütle dedektörüdür. Farmakope'nin 2025 baskısı, 100'den fazla ilaç çeşidinin analizi ve kalite kontrolü için Evaporatif Işık Saçılımı Tespiti'nin (ELSD) kullanımını belirtir. Pratikte ELSD, astragalosid, karbonhidratlar, aminoglikozidler ve kolesterol gibi ultraviyole (UV) absorpsiyonu olmayan bileşiklere daha sık uygulanır ve sıklıkla UV ve floresans dedektörlerine tamamlayıcı bir tespit yöntemi olarak hizmet eder. Bununla birlikte ELSD sonuçları, mobil faz bileşimi, organik solvent konsantrasyonu, elüsyon modu ve nebülizasyon koşulları dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenir. Bu nedenle doğru ve tutarlı analitik sonuçlar elde etmek için bu faktörlerin sonuçlar üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi önemlidir.
2025 Farmakopesi'nin II. Kısmındaki spektinomisin hidroklorür için analitik yönteme atıfta bulunan ve ICH QbD ilkeleri tarafından yönlendirilen bu çalışma, analitik koşulları taramak ve optimize etmek için ortogonal bir deney tasarımı kullanmıştır.
Şekil 1 Spektinomisin Hidroklorür
2. Araç ve Yöntem
Bu çalışmada Wayeal'in LC3200 serisi HPLC sistemi kullanılarak kromatografik analiz yapıldı. Cihaz konfigürasyonu dörtlü bir gradyan pompasını, bir otomatik örnekleyiciyi, bir sütun bölmesini ve bir Buharlaşmalı Işık Saçılım Dedektörünü içeriyordu. Sistem kontrolü ve veri toplama/işleme, SmartLab 2.0 kromatografi yazılımıyla gerçekleştirildi.
Tablo 1 HPLC Koşulları
| Kromatografi sütunu |
Nova Atom PC18 (4,6*250mm, 5μm) |
| Mobil faz |
0.1mol/L Trifloroasetik asit sulu çözeltisi |
| Akış hızı (mL/dak) |
0,6 |
| Sütun sıcaklığı |
35 |
| Enjeksiyon hacmi (μL) |
20 |
| ELSD Nebulizatör sıcaklığı (°C) |
85 |
| ELSD Evaporatör sıcaklığı (°C) |
80 |
| ELSD Algılama sıcaklığı (°C) |
50 |
| Gaz Akış Hızı (SLM) |
0,2 |
3. Çözüm Hazırlama
Örnek çözüm:Spektinomisin hidroklorürün stok çözeltisi, müşteri tarafından 10 mg/mL etiketli konsantrasyon ve %99,8 saflıkla sağlandı.
0.1M Trifloroasetik asit sulu çözeltisi:6,8 mL trifloroasetik asidi 1000 mL'lik ölçülü bir şişeye tam olarak pipetleyin. Arıtılmış suyla işarete kadar seyreltin ve iyice karıştırın. Son olarak, solüsyonu kullanmadan önce 0,45μm selüloz membran filtreden vakumla filtreleyin.
Standart Çözümler:Stok çözelti, sırasıyla 0,15, 0,25, 0,35, 0,50 ve 0,70 mg/mL konsantrasyonlarda örnek çözeltiler hazırlamak üzere saf suyla seyreltildi. Daha sonra her çözelti, kullanımdan önce 0.45μm selüloz membran filtreden filtrelendi.
4. Sonuç ve Tartışma
Çin Farmakopesi, spektinomisin hidroklorür girişi kapsamında ilgili maddeleri ve ana bileşen içeriğini analiz etmek için aynı kromatografik koşulları kullanır. Yöntem, "dedektörün gerçek koşullara göre yapılandırılabileceğini" belirtir. Çalışma sırasında ELSD3260'ın enstrümantal özellikleri, analitik yöntemin gereklilikleri ve ilgili literatür dikkate alınarak, birden fazla deneysel parametreyi taramak için Plackett-Burman deney tasarımı kullanıldı (Tablo 2 ve 3). Daha sonra ELSD dedektörünün tepe alanı yanıtını optimize etmek için bir Box-Behnken tasarımı (Tablo 4) kullanıldı.
Tablo 2 Plackett-Burman Deney Tasarımı
| HAYIR. |
Akış Hızı (mL/dak) |
Kolon Sıcaklığı(°C) |
Nebulizatör Sıcaklığı （°C） |
Evaporatör Sıcaklığı （°C） |
Algılama sıcaklığı (°C) |
Gaz Akış Hızı (SLM) |
Sütun Sonrası Tazminat |
| 1 |
0,8 |
35 |
60 |
50 |
50 |
0,4 |
HAYIR |
| 2 |
0,6 |
35 |
50 |
60 |
50 |
0,6 |
HAYIR |
| 3 |
0,6 |
30 |
60 |
60 |
50 |
0,4 |
Evet |
| 4 |
0,8 |
30 |
60 |
60 |
40 |
0,6 |
HAYIR |
| 5 |
0,6 |
35 |
60 |
50 |
40 |
0,6 |
Evet |
| 6 |
0,8 |
30 |
50 |
50 |
50 |
0,6 |
Evet |
| 7 |
0,8 |
35 |
50 |
60 |
40 |
0,4 |
Evet |
| 8 |
0,6 |
30 |
50 |
50 |
40 |
0,4 |
HAYIR |
Tablo 3 Plackett-Burman Deney Sonuçlarının ANOVA Analizi
| Varyasyonun Kaynağı |
Katsayı |
t değeri |
p değeri |
Önem |
| Akış hızı |
-6.687 |
-8.10 |
<0,01 |
2 |
| Sütun sıcaklığı |
0,191 |
0.22 |
0,824 |
6 |
| Nebulizatör Sıcaklığı （°C） |
5.342 |
6.29 |
<0,01 |
3 |
| Evaporatör Sıcaklığı （°C） |
4.135 |
4.87 |
<0,01 |
4 |
| Algılama sıcaklığı (°C) |
0,171 |
0.21 |
0,842 |
7 |
| Gaz Akış Hızı (SLM) |
-10.381 |
-12.23 |
<0,01 |
1 |
| Sütun Sonrası Tazminat |
-2.559 |
-3.02 |
<0,01 |
5 |
Tablo 3'ten görülebileceği gibi gaz akış hızı, mobil faz akış hızı ve kolon sonrası kompanzasyon olumsuz etkiler göstermiştir. Spesifik olarak, kolon sonrası dengelemenin devre dışı bırakılmasıyla birlikte gaz akış hızının ve mobil faz akış hızının azaltılması, kromatografik tepe tepkisini artırabilir. Bununla birlikte, mobil faz akış hızının azaltılması, tepe noktasının genişlemesinin artmasına ve algılama hassasiyetinin azalmasına neden olabilir. Bu nedenle akış hızı standart yöntemle tutarlı tutuldu. Kolon sıcaklığı ve algılama sıcaklığı olumlu etkiler gösterirken yanıt değerini önemli ölçüde artırmadı. Sonuç olarak, sonraki çalışmalar gaz akış hızının, nebülizör sıcaklığının ve buharlaştırıcı sıcaklığının optimize edilmesine odaklanacaktır.
Gaz akış hızının, nebülizatör sıcaklığının ve buharlaştırıcı sıcaklığının tepki değeri üzerindeki etkileri, tepki yüzeyi metodolojisi çerçevesinde Box-Behnken deney tasarımı kullanılarak araştırıldı. Deney tasarımı Tablo 4'te sunulmaktadır.
Tablo 4 Box-Behnken Deney Tasarımı
| HAYIR. |
Gaz Akış Hızı (SLM) |
Nebulizatör Sıcaklığı （°C） |
Evaporatör Sıcaklığı （°C） |
| 1 |
0,15 |
75 |
80 |
| 2 |
0,15 |
85 |
80 |
| 3 |
0,25 |
75 |
80 |
| 4 |
0,25 |
85 |
80 |
| 5 |
0,15 |
80 |
75 |
| 6 |
0,15 |
80 |
85 |
| 7 |
0,25 |
80 |
75 |
| 8 |
0,25 |
80 |
85 |
| 9 |
0,2 |
75 |
75 |
| 10 |
0,2 |
75 |
85 |
| 11 |
0,2 |
85 |
75 |
| 12 |
0,2 |
85 |
85 |
| 13 |
0,2 |
80 |
80 |
Spektinomisin hidroklorürün tespit koşulları, yanıt yüzeyi metodolojisi (Şekil 2) kullanılarak ve enstrümantal parametre aralıkları dikkate alınarak tepe alanı varyasyonunun simüle edilmesiyle belirlendi: nebülizör sıcaklığı 85°C, buharlaştırıcı sıcaklığı 80°C, dedektör sıcaklığı 50°C ve gaz akış hızı 0,2 SLM.
A. Gaz Akış Hızının ve Evaporatör Sıcaklığının Pik Alanına Etkisi
B. Gaz Akış Hızının ve Nebulizatör Sıcaklığının Pik Alanına Etkisi
C. Nebulizatör Sıcaklığı ve Evaporatör Sıcaklığının Pik Alanına Etkisi
Şekil 2 Zirve Alanındaki Değişim
Enjeksiyon Hassasiyeti
Spektinomisin hidroklorürün stok çözeltisi 0,35 mg/mL'ye seyreltildi ve belirtilen kromatografik koşullar altında kromatogramlar kaydedilerek altı ardışık enjeksiyon gerçekleştirildi. Spektinomisin hidroklorür kromatografik zirvesi için alıkonma süresinin ve zirve alanının nispi standart sapmaları (%RSD) hesaplandı. Sonuçlar Tablo 5'te gösterilmektedir.
Tablo 5 Enjeksiyon Hassasiyet Testi Sonuçları
| HAYIR. |
Saklama Süresi (dk) |
Zirve Alanı (SU*'lar) |
| 1 |
7.625 |
259.124 |
| 2 |
7.615 |
245.223 |
| 3 |
7.618 |
270.250 |
| 4 |
7.608 |
237.267 |
| 5 |
7.627 |
254.977 |
| 6 |
7.613 |
255.548 |
| RSD (%) |
0,09 |
4.49 |
özgüllük
Analitik prosedür validasyonuna ilişkin ICH Q2(R2) kılavuzuna ve Çin Farmakopesi Genel Bölüm 〈9101〉 Analitik Yöntem Validasyonuna ilişkin Kılavuzlara göre, optimize edilmiş yöntem özgüllük, doğrusal aralık, doğruluk ve tekrarlanabilirlik açısından doğrulanmıştır.
Saflaştırılmış su ve numune çözeltisi (0,35 mg/mL), kaydedilen kromatogramlara paralel olarak analiz edildi. Sonuçlar (Şekil 3), arıtılmış su kromatogramında spektinomisin hidroklorürün alıkonma süresinde hiçbir kromatografik zirve göstermezken, numune çözeltisindeki spektinomisin hidroklorürün zirvesi, bitişik zirvelerden temel ayrım elde etti (R > 1,5).
Şekil 3 Spektinomisin Hidroklorür Numunesinin Analitik Sonuçları (0,35mg/mL)
Doğrusal Aralık
Standart çözelti hazırlama yöntemine göre üç paralel spektinomisin hidroklorür stok çözeltisi örneği hazırlayın, bunları kromatografik koşullar altında analiz edin ve kromatogramları kaydedin. Kromatografik tepe alanlarını ve karşılık gelen konsantrasyonları kullanarak regresyon analizi yapın.
Şekil 4 Doğrusallık Testi Sonuçları (Log-Dönüştürülmüş ve Dönüştürülmemiş)
Literatüre göre, ELSD yanıt değeri ile konsantrasyon arasındaki ilişki doğrusal değildir ve regresyon analizini gerçekleştirmeden önce hem yanıt değerinin hem de konsantrasyonun logaritmik dönüşümünü gerektirir [8,9,10]. Deneysel verilere logaritmik dönüşüm uygulandıktan sonra doğrusal regresyon eğrisinin korelasyon katsayısı 0,999'u aştı; bu, logaritmik dönüşüm olmadan elde edilen sonuçtan önemli ölçüde daha iyidir (Şekil 4'te gösterildiği gibi).
Doğruluk ve Tekrarlanabilirlik
Spektinomisin hidroklorür stok çözeltisi, 0,25, 0,35 ve 0,50 mg/mL konsantrasyonlara kadar seyreltildi. Her konsantrasyon için üç paralel numune hazırlandı, belirtilen kromatografik koşullar altında analiz edildi ve kromatogramlar kaydedildi. İçerik, regresyon eğrisi kullanılarak hesaplandı ve geri kazanım ve tekrarlanabilirlik değerlendirildi. Sonuçlar Tablo 6'da sunulmaktadır.
Tablo 6 Geri Kazanım Testi Sonuçları
| HAYIR. |
Gerçek Değer (mg/Ml) |
Hesaplanan Değer (mg/Ml) |
İyileşmek (%) |
Kurtarma RSD'si (%) |
| 1 |
0,25 |
0,252 |
100.8 |
1.36
|
| 2 |
0,25 |
0,251 |
100.4 |
| 3 |
0,25 |
0,246 |
98.4 |
| 4 |
0,35 |
0,348 |
99.4 |
| 5 |
0,35 |
0,352 |
100.6 |
| 6 |
0,35 |
0,344 |
98.3 |
| 7 |
0,50 |
0,505 |
101.0 |
| 8 |
0,50 |
0,513 |
102.6 |
| 9 |
0,50 |
0,504 |
100.8 |
Nicelik Sınırı (LOQ)
Streptomisin hidroklorür stok çözeltisini 12μg/mL konsantrasyona kadar seyreltin. Numuneyi kromatografik koşullar altında analiz edin ve kromatogramı kaydedin. Streptomisin hidroklorür kromatografik zirvesinin sinyal-gürültü oranını (S/N) hesaplayın ve tekrarlanabilirliğini belirleyin. Sonuçlar Tablo 7'de gösterilmektedir.
Tablo 7 LOQ Test Sonucu
| HAYIR. |
SNR |
Zirve Alanı (SU*'lar) |
Zirve Alanı RSD (%) |
| 1 |
15.647 |
3.416 |
8.45
|
| 2 |
10.634 |
2.928 |
| 3 |
15.728 |
3.145 |
| 4 |
12.842 |
3.529 |
| 5 |
14.662 |
3.396 |
| 6 |
11.076 |
3.730 |
Sonuçlar, ICH kılavuzunun S/N > 10 gerekliliği kapsamında, spektinomisin hidroklorür çözeltisinin bu konsantrasyonu için tepe alanının göreceli standart sapmasının kriterleri karşıladığını göstermektedir. Bu nedenle spektinomisin hidroklorür için niceliksel sınır standardı görevi görebilir.
5. Sonuç
Farmakope yöntemine dayanan bu çalışma, spektinomisin hidroklorürün miktarının belirlenmesi için güvenilir ve sağlam bir analitik prosedür oluşturmuştur. Buharlaşmalı ışık saçılım dedektörü (ELSD) koşulları sistematik olarak optimize edildi. Optimize edilmiş yöntem, gelişmiş kararlılık ve doğruluk, daha yüksek algılama hassasiyeti ve tatmin edici bir doğrusal aralık gösterdi.
ELSD3260 dedektörü, yeni tasarlanmış ve geliştirilmiş düşük sıcaklıklı, bölünmüş akışlı bir dedektördür. Hem uçucu olmayan hem de yarı uçucu maddelerin analizi için uygundur ve UV emilimi olmayan bileşikler için değerli bir alternatif sağlar. Bu çalışmada, spektinomisin hidroklorürün analizi için ELSD3260'ın kullanılması, gelişmiş tespit hassasiyetinin yanı sıra mükemmel yanıt değerleri ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlandı. Bu bulgular, bu cihazın spektinomisin hidroklorürün kantitatif analizi için çok uygun olduğunu göstermektedir.
Mesajınız 20-3.000 karakter arasında olmalıdır!
