Propranolol Hidroklorür Tabletlerinde sıvı kromatografi ile nitrosamin kirliliklerinin belirlenmesi

Anahtar Kelimeler: Propranolol, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, nitrozamin safsızlıkları

1. Cihazlar ve Reaktifler​

1.1 HPLC Sisteminin Konfigürasyon Listesi

1.2 Reaktifler ve Standart Çözeltiler

Tablo 2 Reaktifler ve Standart Çözeltiler

1.3 Deney Malzemeleri ve Yardımcı Ekipmanlar

Ultrasonik temizleyici

Vorteks karıştırıcı

2. Deney Yöntemi

2.1 Çözelti Hazırlama

2.1.1 2mol/L Sodyum Hidroksit Çözeltisi: 4g sodyum hidroksit alın, 50mL suda çözün ve iyice karıştırın.

2.1.2 Asetonitril-Su-Sülfürik Asit (55:45:0.1) Karışımı: 1.6g sodyum dodesil sülfat ve 0.31g tetra-bütilamonyum dihidrojen fosfat alın, 1mL sülfürik asit, 450mL su ve 550mL asetonitril ekleyin. 2 mol/L sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 3.3'e ayarlayın ve iyice karıştırın.

2.1.3 Çözücü: Mobil faz ile aynı.

2.1.4 Doğrusal Çözelti: Uygun miktarda N-Nitroso-propranolol referans standardını hassas bir şekilde tartın, mobil faz ile çözün ve seyreltin, yaklaşık 200ng/mL içeren bir çözelti elde edin. Daha sonra, stok çözeltiden uygun hacimleri altı adet 100mL'lik hacim balonuna hassas bir şekilde aktarın, mobil faz ile işarete kadar seyreltin ve 0.8ng/mL, 1ng/mL, 2ng/mL, 3ng/mL, 4ng/mL ve 6ng/mL konsantrasyonlarında bir standart çalışma eğrisi serisi hazırlamak için iyice karıştırın.

2.1.5 Referans Standart Çözelti: Uygun miktarda N-Nitroso-propranolol referans standardını hassas bir şekilde tartın, mobil faz ile çözün ve seyreltin, yaklaşık 2ng N-Nitroso-propranolol/mL içeren bir çözelti hazırlayın.

2.2 Örnek Hazırlama

2.2.1 Örnek Çözelti: Uygun miktarda ince öğütülmüş propranolol hidroklorür tabletini hassas bir şekilde tartın, mobil faz ile çözün ve seyreltin, yaklaşık 0.27mg propranolol/mL içeren bir çözelti hazırlayın.

2.2.2 Doğruluk Çözeltisi: Yaklaşık 297mg ince öğütülmüş propranolol hidroklorür tabletini 100mL'lik bir hacim balonuna hassas bir şekilde tartın. Uygun miktarda N-Nitroso-propranolol referans standart çözeltisi ekleyin, çözün ve mobil faz ile işarete kadar seyreltin, %100 takviyeli bir örnek hazırlayın. Doğruluk çözeltisini elde etmek için iyice karıştırın.

3. Deney Sonucu

3.1 Özgüllük

Şekil 2 Özgüllük Kromatogramı

Not: Çözücü, N-Nitroso-propranolol'ün tespiti ile etkileşime girmez ve test çözeltisindeki diğer safsızlıkların kromatografik pikleri de N-Nitroso-propranolol safsızlığının belirlenmesi ile etkileşime girmez.

3.2 Doğrusal Test

Şekil 3 N-Nitroso-propranolol Safsızlığının Standart Eğrisi

Not: Deneysel sonuçlar, N-Nitroso-propranolol safsızlık test eğrisinin korelasyon katsayısının (R) 0.999'u aştığını ve testin gerekliliklerini karşıladığını göstermektedir.

3.3 Tekrarlanabilirlik Testi

Şekil 4 2ng/mL Standart için Altı Tekrarlı Enjeksiyonun Kromatogramları

Tablo 3 2ng/mL Standart için Altı Tekrarlı Enjeksiyonun Verileri

Not: Yukarıdaki tabloda gösterildiği gibi, N-nitroso-propranolol'ün alıkonma süresi tekrarlanabilirliği %0.043 ve pik alanı tekrarlanabilirliği %0.464'tür, bu da iyi tekrarlanabilirlik gösterir.

3.4 Doğruluk Testi

Şekil 5 Tabletlerdeki N-Nitroso-propranolol'ün Üst Üste Doğruluk Kromatogramları

Tablo 4 Propranolol Hidroklorür Tabletlerinin Doğruluğu (N-Nitroso-propranolol)

Not: Altı örnekte N-Nitroso-propranolol'ün geri kazanımı %96.98 ile %104.71 arasında değişmekte olup, ortalama geri kazanım %101.38'dir. Yöntem iyi doğruluk ve tekrarlanabilirlik göstermektedir.

3.5 LOD Testi

Şekil 6 2ng/mL Standart Konsantrasyonda N-Nitroso-propranolol'ün Test Kromatogramı

Tablo 5 2ng/mL Standart Konsantrasyonda N-Nitroso-propranolol'ün Referans Test Verileri

Not: Tablodaki 2ng/mL konsantrasyonda N-nitroso-propranolol referans standardı için test verilerine dayanarak, N-nitroso-propranolol için teorik tespit limiti, tespit limiti kriteri olarak 3:1 sinyal-gürültü oranı kullanılarak 0.151ng/mL olarak hesaplanır.

3.6 Bir Marka Tablet Testi

Şekil 7 Bir Marka Tabletin Test Kromatogramı

Not: Marka tabletlerde N-Nitroso-propranolol tespit edilmedi.

4. Sonuç

Propranolol hidroklorür tabletlerindeki nitrozamin safsızlığı N-nitroso-propranolol üzerine yapılan bir çalışma, FDA'nın yakın zamanda yayınlanan Nitrozamin İlaç Maddesiyle İlgili Safsızlıklar (NDSRI) için kabul edilebilir alım seviyelerinin belirlenmesine ilişkin rehber belgesine uygun olarak yürütülmüştür. Bu belgeye göre, AI (Kabul Edilebilir Alım) değeri 1500ng/gün olarak hesaplanır. Bu ürünün maksimum günlük dozu (200mg) dikkate alındığında, tabletlerdeki kontrol limiti 7.5ppm'i geçmemelidir. Yöntem validasyonu, bir UV dedektörü ile donatılmış Wayeal'in yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) serisi kullanılarak gerçekleştirildi. Tablet örnekleri, valide edilmiş tespit yöntemi kullanılarak analiz edildi ve nitrozamin safsızlığı N-nitroso-propranolol tespit edilmedi. Yukarıdaki tüm veriler, enstrümantasyon için farmakope gerekliliklerine uygundur.