Wayeal LCMS-TQ9200 Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Sistemi Kullanılarak Antibiyotik Fermantasyon Kalıntılarında Eritromisin Kalıntılarının Belirlenmesi

Eritromisin, Streptomyces erythreus'un fermantasyonu ile üretilen bir makrolid antibiyotiktir. Antibakteriyel etkisini öncelikle bakteriyel protein sentezini inhibe ederek gösterir. Eritromisin üretimi, öncelikle suş seçimi, tohum kültürü, tanklarda büyük ölçekli fermantasyon, ekstraksiyon ve saflaştırma gibi adımları içeren biyofementasyon teknolojisine dayanır. Fermantasyondan sonra eritromisin, organik çözücüler (bütil asetat gibi) ile ekstrakte edilir, ardından kristalizasyon veya iyon değişim reçinesi ayırımı yoluyla saflaştırılır ve sonuçta klinik sınıf tuzlar (örneğin, eritromisin etilsüksinat) elde edilir. Ancak, eritromisin üretim süreci, artık antibiyotikler, mikrobiyal proteinler ve metabolik yan ürünler içerebilen önemli miktarda miselyal posa (fermantasyon kalıntısı) üretir. Uygun şekilde yönetilmezse, bu kalıntılar çevresel deşarj veya yem katkı maddesi olarak kullanılarak ekolojik zincire girebilir ve çoklu tehlikelere yol açabilir: Kalan eritromisin, toprak ve su kütlelerinde antibiyotik direnç genlerinin yayılmasını teşvik edebilir, mikrobiyal topluluk dengesini bozabilir; gıda zinciri yoluyla amplifiye edilerek, hayvanlarda veya insanlarda dirençli bakteri türlerinin ortaya çıkmasına neden olabilir ve antibiyotik etkinliğini zayıflatabilir; ayrıca, kalıntılar içindeki yetersiz kullanılan organik madde çevresel kirliliğe neden olabilir. Bu nedenle, miselyal kalıntının sıkı bir şekilde düzenlenmesi, eritromisin üretiminden kaynaklanan kirliliği kontrol etmek için kritik bir önlemdir.

Bu deney, miselyal posadaki eritromisin içeriğini belirlemek için Wayeal LCMS-TQ9200 sıvı kromatografi-kütle spektrometresi sistemi kullanılarak, "T/PIAC 00003—2021 Çin İlaç Endüstrisi Birliği Grup Standardı - Antibiyotik kalıntısı, organik gübre baz malzemeleri, mahsuller ve çevresel ortamlarda eritromisin tayini yöntemi" standardına atıfta bulunularak gerçekleştirilmiştir. Deneysel sonuçlar, sistem uygunluk testinin iyi tepe şekli ve iyi doğrusallık gösterdiğini ve deneysel gereksinimleri karşıladığını göstermektedir.

1. Enstrüman ve Reaktifler

1.1 LCMS Konfigürasyon Listesi

Tablo 1 Enstrüman Konfigürasyon Listesi

1.2 Reaktifler ve Standartlar

Tablo 2 Reaktifler ve Standartlar Listesi

1.3 Deney Malzemesi ve Yardımcı Ekipman

Ultrasonik temizleyici

Vorteks karıştırıcı

Yüksek Hızlı santrifüj

2. Deney Yöntemi

2.1 Örnek Ön İşlemi

0.5g numuneyi (0.001 g'a kadar doğru) cam tıpalı bir test tüpüne tartın. 50mL asetonitril ekleyin, karışımı homojenleştirmek için 1 dakika vorteks yapın ve 20 dakika ultrason destekli ekstraksiyon gerçekleştirin. Daha sonra karışımı 50mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4000rpm'de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantın uygun bir miktarını toplayın ve 0.22μm'lik bir filtre membranından geçirin. İlk filtrattan en az 1mL'sini atın, ardından kalan filtratı analiz için kehribar renkli bir LC flakonuna aktarın.

2.2 Deney Koşulları

2.2.1 Sıvı Kromatografi Yöntemi Koşulları

Kromatografi kolonu: C18 1.7μm 2.1x50mm

Mobil faz: A: Asetonitril, B: Suda %0.1 Formik asit

Akış hızı: 0.3mL/dak

Kolon sıcaklığı: 30℃

Enjeksiyon hacmi: 2μL

2.2.2 Kütle Spektrometresi Yöntemi Koşulları

Tablo 3 Kütle Spektrometrisi İyon Kaynağı Parametreleri

3. Deney Sonucu

3.1 Sistem Uygunluk Testi

Sistem uygunluk testi sonuçları, yabancı tepe noktalarından herhangi bir girişim olmaksızın iyi tanımlanmış hedef tepe noktaları gösterdi ve tüm deneysel gereksinimleri karşıladı.

Şekil 1 Eritromisin A Standart Çalışma Çözeltisinin (0.5ng/mL) Kromatogramı

3.2 Doğrusal Aralık

Eritromisin A için kalibrasyon eğrisi, ara konsantrasyonlu çalışma çözeltileri kullanılarak standart çözeltinin seri olarak seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Eğri, 0.5-500ng/mL aralığında mükemmel doğrusallık göstermiş ve korelasyon katsayısı (R²) 0.99'dan büyük olmuştur.

Tablo 4 Eritromisin A'nın Doğrusal Aralığı

Şekil 2 Eritromisin A için Kalibrasyon Eğrisi

3.3 Saptama Sınırı (LOD) ve Kantifikasyon Sınırı (LOQ)

Bu yöntemde, eritromisin A standart çözeltisi için saptama sınırı (LOD) ve kantifikasyon sınırı (LOQ) sırasıyla 0.2ng/mL ve 0.5ng/mL olarak belirlenmiştir. İlgili sinyal-gürültü oranları (S/N) 110.02 ve 292.20 olup, 3 ve 10'luk minimum gereksinimleri önemli ölçüde aşmakta ve böylece deneysel duyarlılık kriterlerini karşılamaktadır.

Şekil 3. Eritromisin A'nın LOD ve LOQ'su için Ekstre Edilmiş İyon Kromatogramları

3.4 Hassasiyet Testi

Eritromisin A çözeltisi art arda yedi kez enjekte edildi ve sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir. Eritromisin A için tutma süresi sapması %0.19 ve tepe alanı sapması %0.96 olup, her ikisi de %5'in altında olup, deneysel gereksinimleri karşılamaktadır.

Şekil 4. Eritromisin A Örneğinin Hassasiyet Kromatogramları (7 Enjeksiyon)

3.5 Örnek Testi

Yukarıda belirtilen ön işlem yöntemini takiben, katı örnekteki hedef tepe alanı 7.4E6 idi. Harici standart yöntemi ile hesaplandığında, örnek çözeltideki eritromisin A içeriği 400 ng/mL olarak belirlenmiştir.

Şekil 5 Eritromisin A Örnek Testinin Kromatogramı

4. Sonuç

Bu yöntem, antibiyotik fermantasyon kalıntılarında eritromisin A içeriğinin belirlenmesi için Wayeal LCMS-TQ9200 sıvı kromatografi-kütle spektrometresi sistemini kullanmaktadır. Veriler, yöntemin mükemmel performans gösterdiğini göstermektedir: tüm kromatografik tepe noktaları kuyruklanma olmadan optimum şekil sergilemekte ve duyarlılık deneysel gereksinimleri karşılamaktadır. Doğrusal korelasyon katsayısı (R²) 0.99'u aşmaktadır. Yedi ardışık enjeksiyonda tüm bileşikler için tutma süresi ve tepe alanı sapmaları %1 içindedir ve bu da yüksek hassasiyeti göstermektedir. Örnek kromatogramları, yabancı tepe noktalarından herhangi bir girişim göstermemekte ve ölçülen örnek içeriği 400ng/mL'dir. Wayeal LC-MS/MS sistemi ile donatılmış bu yöntem, test örneklerinin rutin kalitatif ve kantitatif analizi için gereksinimleri karşılamaktadır.