Sıvı Kromatografisi ile İçeceklerde Kafein İçeriğinin Belirlenmesi

Dava ayrıntıları

Kafein, kahve çekirdekleri, çay yaprakları ve kakao çekirdekleri gibi hammaddelerde yaygın olarak bulunan doğal bir metilksantin alkaloididir. Karbonatlı içecekler, enerji içecekleri, çay bazlı içecekler ve kahve içecekleri dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen içeceklerde temel bir fonksiyonel katkı maddesi ve karakteristik lezzet bileşiği olarak hizmet eder. Kafeinin orta düzeyde tüketimi, zihni canlandırma ve yorgunluğu giderme gibi fizyolojik etkiler gösterebilir. Ancak, aşırı ve uzun süreli tüketim, çarpıntı, uykusuzluk ve sinirsel aşırı uyarılma gibi olumsuz reaksiyonlara kolayca neden olabilir. Dahası, hamile kadınlar, çocuklar ve kardiyovasküler hastalığı olan bireyler gibi hassas popülasyonlar daha da düşük tolerans eşiklerine sahiptir. Sonuç olarak, çeşitli ülkelerdeki gıda güvenliği standartları, içeceklerdeki kafein içeriği üzerinde açık düzenleyici sınırlar belirlemiştir.

Çin'de, "İçeceklerde Kafeinin Belirlenmesi" (GB 5009.139-2014) başlıklı ulusal gıda güvenliği standardı, içecek matrislerindeki kafeinin nicel belirlenmesi için yasal temel oluşturmaktadır. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), mükemmel çözünürlüğü, matris girişimine karşı güçlü direnci ve yüksek nicel doğruluğu nedeniyle, çeşitli bileşik içecekler, süt içeren içecekler ve bitkisel fonksiyonel içecekler dahil olmak üzere karmaşık matrisli numunelerin analizi için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bu deney, ulusal standart GB 5009.139-2014'te belirtilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemine uygun olarak yürütülmüş, içecek numuneleri için bir numune ön işlem ve sıvı kromatografik ayırma/tespit protokolü oluşturulmuş ve farklı türdeki içeceklerde kafeinin nitel tanımlanması ve nicel analizi gerçekleştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler: yüksek performanslı sıvı kromatografisi; kafein; içecekler; içerik belirleme.

1. Cihaz ve Reaktifler

1.1 Sıvı Kromatografi Sistemi Yapılandırma Listesi

Tablo 1. Cihaz Yapılandırma Listesi

No.	Adı	Adet
1	LC3500 Sıvı Kromatografi Sistemi	1
2	P3500B İkili Yüksek Basınçlı Gradyan Pompası	1
3	CT3500 Kolon Fırını	1
4	AS3500 Ultra Yüksek Performanslı Otomatik Numuneleyici	1
5	SmartLab CDS 2.0 Kromatografi Veri İstasyonu	1
6	C18 Kolon, 5μm, 4.6 × 250 mm	1

1.2 Reaktifler ve Standartlar Listesi

Tablo 2. Reaktifler ve Standartlar Listesi

No.	Reaktif veya Referans Standart	Saflık Derecesi
1	Metanol	LC sınıfı
2	Ultra saf su
3	Magnezyum oksit	AR sınıfı
4	Trikloroasetik asit	AR sınıfı

1.3 Deneysel Malzemeler ve Yardımcı Ekipmanlar

Ultrasonik temizleyici;

Vortex karıştırıcı;

0.45m mikrogözenekli sulu faz filtre membranı.

2. Deney Yöntemi

2.1 Standart Çözeltilerin Hazırlanması

2.1.1 Kafein Standart Stok Çözeltisi (2.0mg/mL): 20mg kafein referans standardını (en yakın 0.1mg'a kadar) tartın, 10mL'lik balon jojeye koyun, çözün ve metanol ile hacme tamamlayın. 4 °C'de buzdolabında saklayın. Raf ömrü 6 aydır.

2.1.2 Kafein Standart Ara Çözeltisi (200g/mL): Kafein standart stok çözeltisinin (2.1.1) 5.0mL'sini 50mL'lik balon jojeye dikkatlice aktarın ve su ile hacme tamamlayın. 4 °C'de buzdolabında saklayın. Raf ömrü 1 aydır.

2.1.3 Kalibrasyon Eğrisi için Kafein Standart Çalışma Çözeltileri: Kafein standart ara çözeltisinin (2.1.2) 0.5 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, 5.0 mL ve 10.0 mL'sini ayrı 10 mL'lik balon jojelere aktarın ve su ile hacme tamamlayın. Bu standart serisinin elde edilen konsantrasyonları sırasıyla 10.0 g/mL, 20.0 g/mL, 40.0 g/mL, 100 g/mL ve 200 g/mL'dir. Kullanımdan hemen önce hazırlayın.

2.2 Numune Ön İşlemi

2.2.1 Kola Tipi İçecekler

(a) Gaz giderme: Numuneyi 40 °C'de ultrasonik temizleyici ile 5 dakika sonikleyin.

(b) Saflaştırma: Numunenin 5g'ını tartın (0.001g'a kadar doğru), 5mL'lik balon jojeye aktarın ve su ile hacme tamamlayın (numune çözeltisindeki kafein içeriğinin kalibrasyon eğrisi aralığında olduğundan emin olun). İyice karıştırın. 0.5g magnezyum oksit ekleyin, iyice çalkalayın ve bekletin. Süpernatantı alın ve sonraki analiz için mikrogözenekli membrandan süzün.

2.2.2 Süt İçeren Sıvı Kahve ve Çay Ürünleri

Numunenin 1g'ını tartın (0.001g'a kadar doğru), 10mL'lik balon jojeye aktarın ve trikloroasetik asit çözeltisi ile hacme tamamlayın (numune çözeltisindeki kafein içeriğinin kalibrasyon eğrisi aralığında olduğundan emin olun). İyice karıştırın ve protein çökeltmesi için bekletin. Süpernatantı alın ve sonraki analiz için mikrogözenekli membrandan süzün.

2.3 Deney Koşulları

2.3.1 Kromatografik Koşullar

Kolon: C18, 4.6 × 250mm, 5m

Mobil faz: Metanol/su = 24/76 (v/v)

Akış hızı: 1.0 mL/dak

Kolon sıcaklığı: 25 °C

Tespit dalga boyu: 272nm

Enjeksiyon hacmi: 10L

3. Deney Sonucu

3.1 Boş