Wayeal LCMS-TQ9200 Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometri Sistemi kullanarak domuz etinde β-agonist kalıntıların belirlenmesi

Bu deney, "GB 31658.22-2022 Ulusal Gıda Güvenliği Standardı — Hayvan Kaynaklı Gıdalarda β-Agonist Kalıntılarının Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Tayini"ne atıfta bulunur ve domuz etindeki β-agonistlerin içeriğini belirlemek için Wayeal LCMS-TQ9200 sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi sistemini kullanır. Deneysel sonuçlar, sistem uygunluk testinin iyi şekilli pikler ve iyi doğrusallık gösterdiğini ve deneysel gereksinimleri karşıladığını göstermektedir. β-agonist standart çalışma çözeltisi için tutma süresi tekrarlanabilirliği %1'in altında ve pik alanı tekrarlanabilirliği %3'ten azdı, bu da iyi tekrarlanabilirlik gösterdiğini belirtmektedir. β-agonistlerin duyarlılık test çözeltisi için, 0,2 ng/mL ve 0,5 ng/mL konsantrasyonlarındaki ana piklerin sinyal-gürültü oranları sırasıyla 3 ve 10'dan önemli ölçüde yüksekti ve deneysel gereksinimleri karşılamaktaydı.

Domuz numune testinde β-agonist tespit edilmedi. Yukarıdaki tüm veriler, standart yöntem tarafından belirtilen cihaz gereksinimlerini karşılamaktadır..

Anahtar Kelimeler:Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometresi; β-Agonistler; Klenbuterol; Gıda Güvenliği.

1. Cihazlar ve Reaktifler

1.1 LCMS'nin Yapılandırma Listesi

Tablo 1 Cihaz Yapılandırma Listesi

1.2 Reaktifler ve Standartlar

Tablo 2 Reaktifler ve Standartlar Listesi

1.3 Deney Malzemesi ve Yardımcı Ekipmanlar

Ultrasonik Temizleyici

Vorteks Karıştırıcı

Su Banyosu Sabit Sıcaklık Çalkalayıcı

Yüksek Hızlı Santrifüj

2. Deney Yöntemi

2.1 Numune Ön İşlemi

2.1.1 Enzimatik Hidroliz ve Ekstraksiyon

Numuneden 2g tartın (±0,05g'ye kadar doğru) 50mL'lik bir santrifüj tüpüne. 6mL 0,2mol/L amonyum asetat tampon çözeltisi ve 40μL β-glukuronidaz/arilsülfataz ekleyin. İyice karıştırmak için vorteks yapın ve 37°C'de karanlıkta, su banyosunda 16 saat çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

2.1.2 Ekstraksiyon, Saflaştırma ve Konsantrasyon

Hazırlanan çözeltiyi alın, 100μL 100ng/mL iç standart çalışma çözeltisi ekleyin, iyice karıştırmak için vorteks yapın ve 8 dakika boyunca 8000 devir/dakika'da santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, 5mL 0,1mol/L perklorik asit çözeltisi ekleyin, karıştırmak için vorteks yapın ve pH'ı perklorik asit kullanarak 1,0 ± 0,2'ye ayarlayın. 8 dakika boyunca 8000 devir/dakika'da santrifüjledikten sonra, süpernatantın pH'ını 10mol/L sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak 10 ± 0,5'e ayarlayın. 15mL etil asetat ekleyin, orta hızda 5 dakika çalkalayın ve 5 dakika boyunca 5000 devir/dakika'da santrifüjleyin. Üst organik katmanı toplayın. Kalan sulu katmana 10mL tert-bütil metil eter ekleyin, orta hızda 5 dakika çalkalayın, 5 dakika boyunca 5000 devir/dakika'da santrifüjleyin ve üst organik katmanı toplayın. Tüm organik katmanları birleştirin ve 50°C'de bir azot akımı altında kuruyana kadar buharlaştırın. Kalıntıyı 5mL %2 formik asit çözeltisinde çözün ve bir kenara ayırın. Sırasıyla 3mL metanol ve 3mL %2 formik asit ile aktive ederek bir karışık modlu katı faz ekstraksiyon kolonunu hazırlayın. Hazırlanan çözeltiyi kolona yükleyin, sırasıyla 3mL %2 formik asit ve 3mL metanol ile yıkayın ve vakum altında kurutun. Kolonu 3mL %5 amonyaklı metanol çözeltisi ile elüe edin. Elüatı 50°C'de bir azot akımı altında kuruyana kadar buharlaştırın. Kalıntıyı 0,5mL metanol–%0,1 formik asit çözeltisinde (10:90, hacim/hacim) yeniden çözün, iyice karıştırın ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi ile analiz için 0,22μm mikroporöz bir membrandan filtreleyin.

2.2 Deney Koşulları

2.2.1 Sıvı Kromatografik Koşullar

Kromatografi kolonu” C18, 1,8μm 2,1*100mm

Mobil faz : A : Suda %0,1 Formik Asit; B: Metanol

Akış hızı: 0,3 mL/dak

Kolon sıcaklığı: 40°C

Enjeksiyon hacmi: 3μL

3. Sistem Uygunluk Testi

Sistem uygunluk testi, hedef piklerin iyi şekilli olduğunu ve diğer safsızlık piklerinden hiçbir girişim olmadığını ve deneysel gereksinimleri karşıladığını göstermektedir.

Şekil 1 Yedi β-Agonistin Testinin Kromatogramı (1ng/mL)

3.2 Doğrusal Aralık

β-agonist standart çözeltileri alınarak ve ara konsantrasyon çalışma çözeltileri kullanılarak, kademeli olarak bir standart eğri hazırlandı. Yedi β-agonist için doğrusal aralık 0,5–50ng/mL idi ve R² > 0,99 idi, bu da iyi bir doğrusal ilişki olduğunu göstermektedir.

Tablo 3 β-Agonistlerin Doğrusal Aralıkları Tablosu

Şekil 2 Yedi β-Agonistin Standart Eğri Kromatogramı

3.3 Saptama Sınırı (LOD) ve Kantifikasyon Sınırı (LOQ)

Bu yöntemde, β-agonistler için saptama sınırı (LOD) ve kantifikasyon sınırı (LOQ) sırasıyla 0,2ng/mL ve 0,5ng/mL olarak ayarlanmıştır. Bu yöntemde her bir bileşik için, LOD ve LOQ için belirtilen konsantrasyonlardaki sinyal-gürültü oranı sırasıyla 3 ve 10'dan büyüktür ve deneysel duyarlılık gereksinimlerini karşılamaktadır.

Tablo 4 Her Bir Bileşiğin LOD ve LOQ'sunun Karşılık Gelen Sinyal-Gürültü Oranları

Şekil 3 LOD ve LOQ Konsantrasyonunda Yedi β-Agonistin İyon Kromatogramları

3.4 Hassasiyet Testi

Düşük, orta ve yüksek konsantrasyonlarda β-agonist standart maddelerin bir karışım çözeltisi alındı ve tutma süresi ve pik alanı sapmalarını karşılaştırmak için art arda altı kez enjekte edildi. Sonuçlar aşağıdaki tabloda gösterilmektedir. Tüm β-agonistler %1'den az tutma süresi sapmaları ve %3'ten az pik alanı sapmaları gösterdi ve deneysel gereksinimleri karşıladı.

Tablo 5 Her Bir Bileşik İçin Hassasiyet Testi

Şekil 4 Yedi β-Agonistin Hassasiyet Testi Kromatogramları (6 Enjeksiyon)

3.5 Numune Testi

Piyasadan satın alınan domuz numuneleri, belirtilen ön işlem yöntemine göre test edildi ve β-agonist tespit edilmedi. Yedi β-agoniste karşılık gelen tutma sürelerinde kromatografik pik gözlenmedi, diğer pikler ise enzimatik hidrolizden sonraki matris sinyallerini temsil etmektedir.

Şekil 5 Domuz Numune Testi Kromatogramı

4. Sonuç

Bu yöntem, domuz etindeki β-agonistlerin tayini için Wayeal LCMS-TQ9200 sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi sistemini kullanır. Veriler, tüm kromatografik piklerin kuyruklanma olmadan iyi şekil gösterdiğini, duyarlılığın deneysel gereksinimleri karşıladığını, doğrusal korelasyon katsayılarının 0,99'u aştığını ve hassasiyetin, her bir bileşiğin altı ardışık enjeksiyonu için %1'in altında tutma süresi sapmaları ve %3 içinde pik alanı sapmaları ile tatmin edici olduğunu göstermektedir. Domuz numune testlerinde β-agonist tespit edilmedi. Bu sonuçlar, Wayeal LC-MS/MS sistemi ile donatılmış yöntemin, hedef analitler için rutin nitel ve nicel tespit gereksinimlerini karşıladığını göstermektedir.