62/2000 Bebeklerin ve küçük çocukların sağlığını koruyun! Wanyi iyon kromatografisi yedi tür insan sütünü belirler

Önsöz

İnsan sütü oligosakkaritleri (HMO'lar), insan sütünde doğal olarak bulunan ve polimerizasyon derecesi 3'ü geçmeyen bir oligosakkarit grubudur; laktoz ve yağdan sonra insan sütündeki üçüncü en büyük katı bileşendir. Bağırsak florasını düzenlerler - özellikle bebek bağırsağında Bifidobacteriaceae kolonizasyonunu teşvik ederler - aynı zamanda bağırsak sağlığını korur, bağışıklık ve beyin gelişimini destekler ve enfeksiyon önleyici etkiler göstererek bebek büyümesinde önemli bir rol oynarlar. İlk HMO ile zenginleştirilmiş bebek maması 2015 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde piyasaya sürüldüğünden beri, dünya çapında HMO içeren çok çeşitli bebek mamaları, süt ve süt ürünleri, sindirim sağlığı takviyeleri ve fonksiyonel gıdalar satılmıştır. 1 Haziran 2023 itibarıyla ABD ve AB, kullanım için yedi HMO'yu onaylamıştır: 2'-fukozilaktos, 3'-fukozilaktos, difukozilaktos, lakto-N-neotetroz, lakto-N-tetroz, 3'-siyalilaktos ve 6'-siyalilaktos.

Yaygın HMO tespit yöntemleri arasında, sıvı kromatografisi tespit öncesinde bir türevlendirme reaksiyonu gerektirir, karmaşık numune hazırlama içerir ve türevlendirme reaktifleri genellikle toksiktir; HMO'ların ısıya duyarlı doğası aynı zamanda LC-MS'de düşük yanıt ve zayıf tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Buna karşılık, karbonhidratlar için amperometrik dedektörlü iyon kromatografisi, basit numune hazırlama, yüksek yanıt ve iyi tekrarlanabilirlik sunarak HMO analizi için açık avantajlar sağlar. Bu uygulama notu, elüent olarak manuel olarak hazırlanmış sodyum hidroksit, sodyum asetat ve ultra saf su kullanır ve bebek mamasındaki HMO'ları belirlemek için WAYEAL IC6300 iyon kromatografını kullanır. Yöntem, basit numune hazırlama, yüksek hassasiyet ve iyi doğrusallık özelliklerine sahiptir ve gıdalardaki HMO tespiti için faydalı bir referans sağlar.

Anahtar Kelimeler: iyon kromatografı; insan sütü oligosakkaritleri; amperometrik dedektör.

1. Cihazlar, Ekipmanlar ve Reaktifler

1.1 Reaktifler ve Standartlar

Tablo 1. Reaktifler ve standartların listesi

1.2 Laboratuvar Malzemeleri ve Yardımcı Ekipmanlar

• 1.2.1 Analitik terazi (0,1 mg okunabilirlik);
• 1.2.2 Termostatlı su banyosu;
• 1.2.3 Santrifüj;
• 1.2.4 Sulu polietilersülfon (PES) membran filtreler (0,45 µm);
• 1.2.5 Ultra saf su;
• 1.2.6 Vakum filtrasyon cihazı;
• 1.2.7 RP katı faz ekstraksiyonu (SPE) ön işlem kartuşları;
• 1.2.8 Tek kullanımlık şırıngalar (20 mL, 5 mL).

2. Deneysel Yöntem

2.1 Çözelti Hazırlama

• 2.1.1 200 mmol/L sodyum hidroksit çözeltisi: 10,5 mL %50'lik NaOH pipetleyin, 1000 mL'ye su ile seyreltin ve vakum altında filtreleyin.
• 2.1.2 75 mmol/L NaOH ve 250 mmol/L sodyum asetat karışımı: 20,51 g sodyum asetat tartın, suda çözün ve 1000 mL'lik balon jojeye aktarın; 3,95 mL %50'lik NaOH pipetleyin, ultra saf su ile 1000 mL'ye seyreltin ve vakum altında filtreleyin.
• 2.1.3 %3'lük sülfosalisilik asit çözeltisi: 3,0 g sülfosalisilik asit tartın, suda çözün ve 100 mL'ye seyreltin (taze hazırlayın).
• 2.1.4 Karışık standart stok çözeltisi: 2'-fukozilaktos, 3'-fukozilaktos, 3'-siyalilaktos, 6'-siyalilaktos, lakto-N-tetroz ve lakto-N-neotetroz'dan her birinden 5 mg (en yakın 0,1 mg'a kadar) tartın, 10 mL'lik balon jojeye koyun, suda çözün ve işareti tamamlayarak 500 mg/L'lik karışık stok hazırlayın. Difukozilaktos'tan 1 mg (en yakın 0,1 mg'a kadar) ayrı olarak tartın, 10 mL'lik balon jojeye koyun, çözün ve işareti tamamlayarak 100 mg/L'lik stok hazırlayın.
• 2.1.5 Karışık standart çalışma çözeltileri: Karışık stok çözeltisini (2.1.4) balon jojelere pipetleyin ve 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT ve DFL'yi 0,5, 2, 4, 6, 8 ve 10 mg/L konsantrasyonlarında hazırlamak için su ile seyreltin. Kullanmadan önce taze hazırlayın.

2.2 Numune Hazırlama

Yaklaşık 2,0 g numuneyi küçük bir behere tartın, 50 mL ılık su (yaklaşık 50 °C) ile iyice karıştırın, 40 mL %3'lük sülfosalisilik asit çözeltisi ekleyin, bir balon jojeye aktarın ve 100 mL'ye seyreltin, 10 dakika sonikasyon uygulayın. Filtre kağıdından süzün veya santrifüj yapın (12.000 dev/dak, 15 dakika). Numune çözeltisini bir RP SPE kartuşundan ve ardından 0,45 µm'lik bir sulu membran filtreden geçirin; ilk 3 mL'yi atın ve analiz için elüatı toplayın. Kullanmadan önce RP SPE kartuşunu 20 mL metanol ve ardından 15 mL su ile hazırlayın ve 30 dakika bekletin.

2.3 Deneysel Koşullar

2.3.1 İyon kromatografisi koşulları

3. Sonuçlar

3.1 Doğrusal Aralık

Her bir karışık standart çalışma çözeltisinden uygun bir kısım analiz edildi. Doğrusal aralık 0,5–10 mg/L idi; ölçülen ve nominal konsantrasyonlar arasındaki sapmalar maksimum izin verilen sapma dahilindeydi, R² değerleri 0,999'un üzerindeydi ve tüm bileşenler iyi doğrusallık gösterdi.

Tablo 2. Bileşiklerin doğrusal aralıkları

Şekil 1. Yedi HMO standardının üst üste bindirilmiş kalibrasyon kromatogramları

3.2 Numune Test Sonuçları

1 ve 2 numaralı numuneler 10 kat seyreltildikten sonra test edildi. Yedi HMO'nun her birinin içeriği aşağıdaki gibi hesaplandı: X numunedeki içeriktir (mg/100g); c kalibrasyon eğrisinden numune çözeltisindeki konsantrasyondur (mg/L); V sabit hacimdir (mL); m numune kütlesidir (g); f seyreltme faktörüdür. Hesaplanan içerikler (mg/100g) aşağıdaki gibidir:

Şekil 2. Numune 1'in 10 kat seyreltilmiş iyon kromatogramı

Şekil 3. Numune 2'nin 10 kat seyreltilmiş iyon kromatogramı

Tablo 3. Numune test sonuçları

3.3 Hassasiyet

Dördüncü kalibrasyon seviyesindeki çalışma çözeltisi, 2.3.1'deki koşullar altında altı ardışık enjeksiyonda analiz edildi. Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için yedi HMO içeriğinin RSD'si hesaplandı. Aşağıdaki sonuçlar iyi yöntem hassasiyetini göstermektedir.

3.3.1 Standart Tekrarlanabilirlik Hassasiyeti

Test sonuçları:

Şekil 4. Kalibrasyon standardı S4'ün bağımsız tekrarlanan enjeksiyonlarının üst üste bindirilmiş kromatogramları

Tablo 4. Standardın tekrarlanabilirlik hassasiyeti

3.4 Tespit ve Miktar Tayini Limitleri

LOD: Standart çözeltinin kısımları, 10 µg/L 3'-FL, 30 µg/L DFL, 30 µg/L 2'-FL, 22 µg/L LNnT, 67 µg/L LNT, 67 µg/L 6'-SL ve 160 µg/L 3'-SL içeren bir karışık çözeltiye seyreltildi; 20 paralel numune hazırlandı ve analiz edildi.

LOQ: Standart çözeltinin kısımları, 30 µg/L 3'-FL, 80 µg/L DFL, 90 µg/L 2'-FL, 65 µg/L LNnT, 200 µg/L LNT, 200 µg/L 6'-SL ve 500 µg/L 3'-SL içeren bir karışık çözeltiye seyreltildi; altı paralel numune hazırlandı ve analiz edildi.

Test sonuçları aşağıdaki gibidir:

Tablo 5. Yedi HMO'nun LOD ve LOQ'u için S/N sonuçları

3.5 Özgüllük

Glukoz, fruktoz, sakkaroz ve maltoz standart çözeltilerinden (her biri 100 µL) 10 mL'lik bir balon jojeye eklendi ve Numune 2 çözeltisi ile 67 kat seyreltilerek işareti tamamlandı. Çözelti, bu şekerlerin yedi HMO'nun piklerini etkileyip etkilemediğini kontrol etmek için analiz edildi. Aşağıda gösterildiği gibi, dört şeker, süt tozundaki yedi HMO'nun tayininde önemli bir girişim göstermedi.

Şekil 5. Kalibrasyon S6, Numune 2 ve dört şeker standardı ile spiked edilmiş Numune 2'nin üst üste bindirilmiş kromatogramları

4. Sonuç

Bu doğrulama, gıdalardaki HMO'ları belirleme yöntemini doğrulamak için WAYEAL iyon kromatografını kullandı. Veriler, tüm kromatografik piklerin kuyruklanma olmadan iyi şekilli olduğunu; 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL ve 3'-SL'nin tümünün 60 dakika içinde elüe olduğunu; hassasiyetin ulusal standart gereksinimlerini karşıladığını ve doğrusal korelasyon katsayılarının tümünün 0,999'un üzerinde olduğunu göstermektedir. Hem standartların hem de numunelerin tekrarlanabilirliği iyidir. İki siyalilaktos hariç, LOD ve LOQ µg/L seviyesindedir. Yöntem iyi bir özgüllüğe sahiptir, herhangi bir girişimci safsızlık bulunmamıştır ve genel olarak standart gereksinimlerini karşılamaktadır.